PCR, atau reaksi berantai polimerase, adalah teknik laboratorium canggih yang banyak digunakan dalam kedokteran dan bidang ilmiah lainnya. Diagnostik PCR pada suatu waktu menjadi terobosan nyata dalam ilmu pengetahuan.
Deskripsi
Quantitative PCR adalah jenis PCR real-time.
Ini dipahami sebagai varian PCR, di mana kinetika reaksi dicatat secara konstan, yang memungkinkan untuk mengevaluasi secara kualitatif kandungan sekuens nukleotida DNA spesifik dalam campuran molekul kompleks.
Metode PCR kuantitatif akan dibahas lebih detail di bawah ini.
Inti dari analisis
Metode kultural dan serologis sangat sering digunakan untuk mendiagnosis infeksi. Di bawah yang pertama, antibodi terhadap patogen menular dalam serum darah ditentukan. Kedua, bahan biologis yang diambil dari orang sakit digunakan untuk menabur media tertentu yang menguntungkan bagi pertumbuhan koloni patogen. Diagnostik di keduanyakasus dapat berlangsung berhari-hari atau berminggu-minggu.
Pemeriksaan PCR dapat dilakukan dengan berbagai bahan biologis yang diperoleh dari orang sakit. Darah dan media dan cairan patologis, fisiologis dan biologis lainnya bertindak sebagai sampel. Anda dapat melakukan PCR feses atau urin.
Infeksi atipikal dan virus paling sering didiagnosis dengan PCR kuantitatif, karena mereka mungkin tidak mudah didiagnosis karena sifat spesifik dari proses patologis yang dipicu olehnya. Untuk menentukan infeksi semacam itu, dibutuhkan waktu, di mana antibodi mulai diproduksi di dalam tubuh, ditentukan dengan metode serologis. Tetapi ini tidak dapat diterima dalam beberapa kasus.
Metode pelaksanaan
Metode PCR - deteksi laboratorium infeksi pada sampel yang diisolasi dari pasien (in vitro).
Untuk melakukan reaksi berantai polimerase, diperlukan satu set reagen khusus.
Bahan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan reagen. Tabung reaksi ditempatkan dalam peralatan khusus - penguat PCR, yang dirancang untuk memperkuat (menambah jumlah) fragmen RNA atau DNA yang diinginkan, penguat PCR beroperasi dalam mode siklik. Dalam setiap siklus, jika sampel mengandung urutan RNA atau DNA patogen, maka semakin banyak salinan partikel asam nukleat ini terakumulasi dalam larutan. Anda dapat menentukan keberadaan patogen, dan jumlahnya dalam sampel.
Jenis PCR
Analisis kualitatif dengan PCR memungkinkan Anda mendapatkan hasil berikut:
- negatif ketika patogen yang diinginkan tidak ditemukan dalam sampel;
- positif jika sekuens ditemukan dalam sampel yang merupakan karakteristik patogen tertentu.
Dengan hasil PCR positif, kita dapat berbicara dengan akurasi 95% tentang adanya infeksi yang didiagnosis. Pada saat yang sama, akurasi set PCR yang digunakan untuk tujuan diagnostik mencapai 100%.
Biasanya 5% dari hasil yang salah ditentukan oleh faktor manusia. Misalnya, pelanggaran teknik analisis dan penyimpanan reagen dapat secara signifikan mengurangi keakuratan penelitian.
PCR kuantitatif mendefinisikan konsep viral load. Dimungkinkan untuk menentukan berapa banyak set DNA patogen dalam sampel yang diambil dari pasien.
Tingkat keparahan infeksi berbanding lurus dengan peningkatan jumlah mereka. Anda juga dapat menentukan keberhasilan terapi untuk menurunkan viral load.
Pengajuan biomaterial PCR
PCR kuantitatif dilakukan di klinik, terutama di pagi hari. Selama kunjungan ke dokter, pasien akan diberitahu apa yang perlu diambil: kerokan, apusan, urin atau darah. PCR dapat mendeteksi patogen terlepas dari tingkat kontaminasi bahan.
Untuk analisis positif, secara teori, hanya diperlukan satu patogen dalam sampel. Dalam praktiknya, mereka mencoba menciptakan kondisi yang lebih menguntungkan. Ada beberapa rekomendasi untuk ini:
- jika mereka mengambil kerokan atau swab dari alat kelaminnyaorgan, Anda harus menahan diri dari hubungan intim tiga hari sebelum penelitian;
- Anda tidak dapat melakukan douche dengan obat antibakteri atau mencuci diri sebelum analisis;
- tiga jam sebelum mengambil apusan dari uretra, Anda harus bersabar dan tidak mengosongkan usus Anda.
Jangan ikuti aturan ini saat mendonorkan darah.
Bagaimana interpretasi hasil analisis PCR kuantitatif?
Evaluasi kuantitatif dari hasil yang diperoleh
Dalam sejumlah situasi klinis, masalah efektivitas pengobatan dan / atau dinamika proses patologi muncul. Pertanyaan seperti itu sangat relevan ketika memeriksa orang dengan infeksi kronis (human immunodeficiency virus, hepatitis B dan C). Saat mendiagnosis, mereka didasarkan pada fakta bahwa akumulasi amplikon (produk PCR) sebanding dengan keberadaan salinan gen yang diinginkan dalam sampel yang dianalisis.
Tentu saja, dengan mempertimbangkan hasil PCR kuantitatif dilakukan elektroforesis gel dengan mempelajari intensitas sinyal PCR khusus. Juga, prasyarat untuk penilaian kuantitatif yang benar dari hasil yang diperoleh adalah sampel kontrol andal positif yang mengandung jumlah salinan gen yang diinginkan yang diketahui (misalnya, seribu salinan gen hepatitis C untuk satu reaksi PCR). Beberapa pengenceran serial kontrol kuantitatif memungkinkan kurva kalibrasi dihasilkan dan digunakan untuk mengevaluasi kandungan genokopi klinis dalam spesimen klinis.
Dalam definisi PCR kuantitatif, pencapaian utama adalah penciptaanprobe DNA fluoresen yang ditambahkan ke campuran reaksi secara bersamaan dengan primer sederhana dan memungkinkan Anda untuk melacak proses PCR dalam waktu, yaitu PCR waktu nyata.
Metodologi TaqMan mengacu pada sintesis probe DNA fluoresen yang spesifik untuk bagian tengah amplikon dan memiliki dua label di ujungnya. Salah satunya adalah label fluoresen, yang kedua adalah molekul quencher untuk fluoresensi ini.
Perangkat khusus, yang merupakan hibrida dari fluorimeter dan penguat thermoblock, membuat pengukuran fluoresensi konstan di setiap tabung reaksi (prinsip PCR waktu nyata). Setelah 20-40 siklus PCR, kurva individu akan diperoleh untuk setiap sampel. Jumlah salinan gen yang diinginkan yang terkandung dalam sampel uji dapat dihitung dari kurva kalibrasi dengan sampel kontrol.
Juga, fitur penting dari penerapan PCR dengan metode fluoresen adalah tidak perlu membuka tabung dengan campuran PCR saat memperhitungkan hasilnya. Ini mengurangi kemungkinan kontaminasi ruangan dengan produk amplifikasi, dan tidak perlu mengalokasikan area kerja khusus untuk elektroforesis.
Apa yang ditunjukkan oleh transkrip PCR kuantitatif?
Apa yang sedang ditemukan?
Melalui metode seperti PCR kuantitatif, perubahan kualitatif pada gen ditemukan: penyisipan, penghapusan, dan mutasi titik. Tetapi dengan beberapa kelainan herediter, gejala yang sesuai muncul sebagai respons terhadap perubahan kandungan gen tertentu.
Terima kasihAnalisis kuantitatif memberikan hasil numerik, paling sering dalam IU / ml. Ini berarti bahwa dalam satu mililiter sampel uji, ditemukan sejumlah salinan RNA atau DNA patogen, diukur dalam satuan internasional.
Bergantung pada besarnya, tingkat keparahan infeksi didiagnosis. Darah biasanya diuji untuk menentukan viral load, karena virus bergerak bebas di dalam darah selama sakit.
Fitur
PCR kuantitatif dalam tes darah memiliki dua fitur.
- Analisis dilakukan dengan adanya primer atau deoksiribonukleosida trifosfat, yang diberi label dengan label fluoresen atau radioaktif untuk menentukan secara akurat kandungan produk PCR yang terbentuk.
- Dalam proses PCR, akhiri reaksi lebih awal sebelum terlalu banyak produk PCR yang muncul. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa pada tahap akhir penjenuhan, ketika ada banyak produk PCR, baik enzim itu sendiri maupun substrat bertindak sebagai mata rantai pembatas dari reaksi ini. Akhir siklus PCR berikutnya dalam kondisi seperti itu tidak lagi ditandai dengan penggandaan jumlah produk PCR, perbedaan kuantitatif yang tidak signifikan antara sampel yang berbeda diratakan, yang cukup jelas ditentukan pada tahap awal setelah melewati serangkaian siklus reaksi.
Biaya diagnostik PCR
Penelitian PCR membutuhkan biaya, yang bergantung pada jenis infeksi yang akan diuji, metodologi analisis dan bahan uji. Untuk menentukan satu infeksi, Anda harus memberi dalam200-800 rubel. Biaya untuk mengambil biomaterial juga ditambahkan - sekitar 400 rubel.
