Flow cytometry adalah metode penelitian sitologi yang digunakan untuk analisis sel secara mendalam. Keuntungannya adalah memungkinkan Anda mempelajari setiap sel satu per satu. Jenis analisis ini membantu mengevaluasi beberapa parameter dalam ratusan sel dalam hitungan detik. Akibatnya, sitofluorimetri dianggap sebagai salah satu metode analisis tercepat dan paling akurat yang saat ini tersedia bagi para ilmuwan dan klinisi.
Prinsip
Prinsip flow cytometry didasarkan pada pengukuran hamburan cahaya dan pendaran (fluoresensi) sel. Suspensi sel dilewatkan sebagai aliran dengan kecepatan tinggi melalui sel sitometer, di mana ia disinari dengan laser. Apa yang disebut pemfokusan hidrodinamik juga dilakukan di sana. Mekanismenya adalah aliran dari sel dengan partikel yang dipelajari di outlet mengalir ke jet eksternal, yang memiliki kecepatan lebih tinggi. Akibatnya, partikel disejajarkan dalam rantai yang teratur.
Pra-sel diberi label dengan pewarna fluoresen khusus (fluorokrom). Berkat mereka, sinar lasermenggairahkan cahaya sekunder. Sinyal cahaya yang diterima dicatat oleh detektor. Selanjutnya, informasi diproses menggunakan algoritme perangkat lunak yang memungkinkan Anda menghitung populasi sel individual yang berbeda dalam beberapa kriteria.
Penelitian dengan mikroskop konvensional sering gagal membedakan sel yang berbeda karena terlihat sama. Sitofluorimetri dapat menyediakan data lain (integritas struktur DNA), menganalisis ekspresi protein, kelangsungan hidup sel.
Karena eksitasi fluorokrom memerlukan berkas cahaya dengan panjang gelombang yang berbeda, serta berbagai jenis detektor, instalasi modern dilengkapi dengan beberapa saluran deteksi (dari 4 hingga 30). Jumlah pemancar laser dapat dari 1 hingga 7. Perangkat yang lebih kompleks memungkinkan studi multi-parameter dari beberapa sifat partikel sekaligus.
Kelebihan dan kekurangan
Manfaat flow cytometry antara lain:
- kecepatan pemrosesan tinggi (pendaftaran hingga 30 ribu acara dalam 1 detik);
- kemungkinan untuk mempelajari sejumlah besar sel (hingga 100 juta dalam sampel);
- Menghitung intensitas cahaya fluorescent;
- analisis setiap sel;
- studi simultan tentang proses heterogen;
- pemisahan otomatis data berdasarkan populasi sel;
- visualisasi kualitas hasil.
Fitur lain dari teknologi ini adalahpartikel yang dianalisis dapat diwarnai dengan beberapa larutan fluoresen. Berkat ini, studi multi-parameter terjadi.
Kelemahannya termasuk kerumitan peralatan teknis dan perlunya persiapan sampel khusus.
Sitometer
Perangkat pertama dari jenis ini sudah muncul pada tahun 1968 di Jerman, tetapi kemudian menyebar luas. Saat ini, semua perangkat yang bekerja dengan metode flow cytometry dapat dibagi menjadi 2 jenis:
- perangkat yang mengukur radiasi fluoresen (dua atau lebih panjang gelombang), hamburan cahaya 10° dan 90° (detektor hamburan sisi dan sudut rendah);
- perangkat yang, selain mengukur beberapa parameter seluler, secara otomatis mengurutkan ke dalam grup berdasarkan kriteria ini.
Detektor hamburan maju dirancang untuk menentukan ukuran sel, dan perangkat hamburan samping memungkinkan Anda memperoleh informasi tentang keberadaan butiran intraseluler, rasio volume sitoplasma dan nukleus.
Sitometer klasik, tidak seperti mikroskop cahaya, tidak memungkinkan untuk mendapatkan gambar sel. Namun, dalam beberapa tahun terakhir, perangkat gabungan telah dikembangkan yang mampu menggabungkan kemampuan mikroskop dan sitofluorimeter. Mereka akan dibahas di bawah ini.
Pencitraan Sitometer
Untuk instrumen yang digunakan dalam sitometri aliran klasik,satu fitur adalah karakteristik: jika peristiwa langka terdaftar dalam populasi sel yang dianalisis, maka tidak ada cara untuk menilai apa esensinya. Partikel-partikel ini dapat berupa sisa-sisa sel mati atau kelompok langka dari mereka. Dalam perangkat konvensional, data tersebut dikecualikan dari aliran umum peristiwa, tetapi data itulah yang dapat menjadi nilai khusus untuk analisis ilmiah dan klinis.
Generasi baru dari imaging flow cytometers memungkinkan Anda untuk menangkap gambar dari setiap sel yang melewati aliran melalui zona detektor. Sangat mudah untuk melihatnya dengan mengklik area diagram yang sesuai, yang ditampilkan di monitor komputer.
Area aplikasi
Flow cytometry adalah metode universal yang digunakan di banyak bidang kedokteran dan sains:
- imunologi;
- onkologi;
- transplantology (transplantasi sumsum tulang merah, sel induk);
- hematologi;
- toksikologi;
- biokimia (pengukuran keasaman di dalam sel, studi parameter lain);
- farmakologi (membuat obat baru);
- mikrobiologi;
- parasitologi dan virologi;
- oceanology (studi fitoplankton untuk menilai keadaan badan air dan tugas lainnya);
- analisis nanoteknologi dan mikropartikel.
Imunologi
Sistem kekebalan tubuh manusia terdiri dari berbagai macam sel. Flow cytometry dalam imunologi memungkinkan untuk mengevaluasi struktur dan fungsinya, yaitu untuk melakukan morfofungsionalanalisis.
Penelitian semacam itu membantu untuk memahami sifat kompleks dari kekebalan. Fenotipe sel berubah sebagai akibat aktivasi oleh antigen, perkembangan patologi, dan faktor lainnya. Sitofluorometri dapat memisahkan subpopulasi sel imun dalam campuran kompleks dan mengevaluasi semua perubahannya dari waktu ke waktu.
Onkologi
Salah satu tugas terpenting dalam onkologi adalah diferensiasi sel menurut jenisnya. Prinsip analisis dengan flow cytometry dalam onkohematologi didasarkan pada fenomena berikut: ketika sampel diperlakukan dengan pewarna fluoresen khusus, ia mengikat protein sitoplasma. Setelah pembelahan dalam sel yang berkembang biak secara aktif, isinya berkurang setengahnya. Dengan demikian, intensitas pendaran sel berkurang dua kali lipat.
Ada cara lain untuk mendeteksi sel yang berproliferasi:
- penggunaan pewarna pengikat DNA (propidium iodida);
- penggunaan urasil berlabel;
- registrasi peningkatan level ekspresi protein cyclin, yang terlibat dalam regulasi siklus sel.
