Kromatografi adalah salah satu metode pemisahan zat. Ini digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif selanjutnya dari sifat fisik dan kimia mikropartikel. Variasi dari teknologi ini adalah kromatografi afinitas. Gagasan untuk membedakan senyawa protein menggunakan sifat afinitas molekuler telah dikenal dalam sains selama beberapa dekade. Namun, ia telah menerima perkembangannya hanya dalam beberapa tahun terakhir, setelah pengenalan bahan hidrofilik yang sangat berpori yang digunakan sebagai matriks. Metode ini memungkinkan pemecahan masalah analitik (pemisahan zat dan identifikasinya) dan masalah persiapan (pemurnian, konsentrasi).
Esensi
Kromatografi afinitas (dari kata Latin affinis - "berdekatan", "berhubungan") didasarkan pada interaksi afinitas, yang merupakan pembentukan ikatan yang sangat spesifik antara molekul spacer (ligan atau afinan) dan molekul target. Mekanisme ini tersebar luas di alam (koneksi mediator atau hormon dan reseptor, antibodi danantigen, hibridisasi polinukleotida dan jenis proses lainnya). Dalam pengobatan, kromatografi afinitas telah digunakan untuk tujuan praktis sejak tahun 1951
Komponen dipisahkan sebagai berikut:
- larutan kerja yang mengandung zat yang akan diisolasi dilewatkan melalui sorben;
- ligan yang terdeposit pada matriks sorben menahan zat ini;
- terkonsentrasi (akumulasi);
- ekstraksi zat yang diisolasi dari sorben dengan mencuci dengan pelarut.
Metode ini memungkinkan Anda untuk mengisolasi seluruh sel. Perbedaan dari kromatografi serapan tradisional adalah adanya ikatan biospesifik yang kuat dari komponen yang diisolasi dengan sorben, yang ditandai dengan selektivitas yang tinggi.
Adsorben
Bahan berikut digunakan sebagai adsorben:
- Senyawa gel berdasarkan agarosa, polisakarida yang diperoleh dari agar. Yang paling umum digunakan adalah 3 varietas: sepharose 4B, CL (cross-linked agarose) dan affi-gel. Komposisi terakhir adalah gel agarosa dan poliakrilamida yang dimodifikasi. Ini memiliki kelembaman biologis yang lebih besar, ketahanan kimia dan termal yang tinggi.
- Silica (silika gel).
- Kaca.
- Polimer organik.
Untuk menghilangkan hambatan mekanis selama kontak ligan, zat tambahan digunakan untuk memisahkannya dari pembawa (peptida, diamina, poliamina, oligosakarida).
Peralatan
Peralatan kromatografi afinitas mencakup unit utama berikut:
- tangki penyimpanan untuk fase gerak (eluen);
- pompa tekanan tinggi untuk suplai sedang (paling sering bolak-balik);
- filter untuk membersihkan eluen dari debu;
- perangkat dosis;
- kolom kromatografi untuk pemisahan campuran;
- detektor untuk mendeteksi komponen terpisah yang meninggalkan kolom;
- perekam kromatogram dan unit mikroprosesor (komputer).
Untuk mengurangi jumlah udara terlarut, helium pertama-tama dilewatkan melalui fase gerak. Untuk mengubah konsentrasi eluen, dipasang beberapa pompa yang dikendalikan oleh programmer. Kolom kromatografi terbuat dari baja tahan karat (untuk meningkatkan persyaratan ketahanan korosi), kaca (opsi universal) atau akrilik. Untuk tujuan preparatif, diameternya dapat bervariasi dari 2 hingga 70 cm. Dalam kromatografi analitik, digunakan kolom mikro 10-150 m.
Untuk meningkatkan sensitivitas detektor, reagen dimasukkan ke dalam campuran, yang berkontribusi pada pembentukan zat yang menyerap lebih banyak sinar di daerah spektrum ultraviolet atau tampak.
Metodologi
Ada 2 jenis utama kromatografi afinitas cair:
- Kolom, di mana kolom diisi dengan fase diam dan campuran dilewatkan melaluinya dengan aliraneluen. Pemisahan dapat terjadi di bawah tekanan atau di bawah gravitasi.
- Lapisan tipis. Eluen bergerak sepanjang lapisan adsorben datar di bawah pengaruh gaya kapiler. Adsorben diaplikasikan pada pelat kaca, batang keramik atau kuarsa, foil logam.
Tahapan utama pekerjaan meliputi:
- persiapan adsorben, fiksasi ligan pada pembawa;
- memasukkan campuran pemisahan ke kolom kromatografi;
- pemuatan fase gerak, pengikatan komponen oleh ligan;
- penggantian fase untuk mengisolasi zat yang terikat.
Tujuan
Kromatografi afinitas digunakan untuk mengisolasi jenis zat berikut (jenis ligan yang digunakan ditunjukkan dalam tanda kurung):
- analog inhibitor enzimatik, substrat dan kofaktor (enzim);
- zat bioorganik dengan tanda keterasingan genetik, virus dan sel (antibodi);
- karbohidrat dengan berat molekul tinggi, polimer monosakarida, glikoprotein (lektin);
- protein nuklir, nucleotidyltransferases (asam nukleat);
- reseptor, protein transpor (vitamin, hormon);
- protein berinteraksi dengan membran sel (sel).
Teknologi ini juga digunakan untuk mendapatkan enzim amobil, dan mengikatnya ke selulosa memungkinkan produksi imunosorben.
Kromatografi protein pengikat DNA
Isolasi protein pengikat DNA dilakukan dengan menggunakanheparin. Glikosaminoglikan ini mampu mengikat berbagai molekul. Kromatografi afinitas protein golongan ini digunakan untuk mengisolasi zat-zat seperti:
- faktor inisiasi dan pemanjangan translasi (sintesis molekul asam nukleat dan protein);
- restrictases (enzim yang mengenali urutan tertentu dalam DNA untai ganda);
- DNA ligase dan polimerase (enzim yang mengkatalisis penggabungan dua molekul untuk membentuk ikatan kimia baru dan terlibat dalam replikasi DNA);
- inhibitor protease serin yang berperan penting dalam proses imun dan inflamasi;
- faktor pertumbuhan: fibroblas, Schwann, endotel;
- protein matriks ekstraseluler;
- reseptor hormon;
- lipoprotein.
martabat
Metode ini adalah salah satu yang paling spesifik untuk isolasi senyawa reaktif (enzim dan agregat yang lebih besar - virus). Namun, digunakan tidak hanya untuk mengisolasi zat aktif biologis.
Deteksi antibodi dalam jumlah kecil, penilaian kuantitatif asam poliadenilat, penentuan cepat massa molekul dehidrogenase, penghilangan polutan tertentu, studi tentang kinetika aktivasi bentuk tripsin yang tidak aktif, struktur molekul manusia interferon - ini bukan seluruh daftar studi di mana afinitas digunakan kromatografi. Penggunaan di klinik karena kelebihannya seperti:
- Kemampuan pembersihan yang efektifprotein, polisakarida, asam nukleat. Mereka sedikit berbeda dalam sifat fisik dan kimia dan kehilangan aktivitas selama hidrolisis, denaturasi dan jenis perawatan lain yang digunakan dalam metode lain.
- Kecepatan pemisahan zat, sifat dinamis proses.
- Tidak perlu pemurnian enzim khusus dan homogenisasi isoenzim untuk menentukan konstanta disosiasi.
- Mampu memisahkan berbagai macam zat.
- Konsumsi ligan rendah.
- Kemungkinan pemisahan zat dalam volume besar.
- Proses pengikatan makromolekul biologis yang reversibel.
Teknik ini dapat dikombinasikan dengan yang lain, untuk memaksakan medan tambahan (gravitasi, elektromagnetik). Hal ini memungkinkan Anda untuk memperluas kemampuan teknis kromatografi.
Rekayasa enzimatik
Berkat metode ini, pengembangan aktif cabang baru bioteknologi - rekayasa enzim dimulai.
Kromatografi afinitas untuk isolasi enzim memiliki keuntungan sebagai berikut:
- mendapatkan enzim dalam jumlah besar karena waktu yang lebih singkat, akibatnya - penurunan harga;
- imobilisasi enzim dapat secara signifikan memperluas cakupan aplikasinya dalam kedokteran dan industri;
- Hubungan enzim dengan pendukung padat yang tidak larut memungkinkan untuk mempelajari pengaruh lingkungan mikro dan arah reaksi, yang memainkan peran penting dalam proses alami dan fisiologis.
